تحمل كل شهادة تحليل لببتيد بحثي نسبة نقاء، ويتم تحديد هذا الرقم دائمًا تقريبًا بواسطة HPLC. يشرح هذا الدليل ما تفعله هذه التقنية، وكيف تتحقق هذه النسبة، والأهم من ذلك، ما لا تقوله.
يقوم HPLC بفصل مكونات العينة والتعبير عن الببتيد المستهدف على شكل أ النسبة المئوية لإجمالي مساحة الذروة. لذا فهي نسبة وليست وزنًا: تبقى المياه المتبقية والأيونات المضادة بعيدة عن الأنظار، ولا يؤكد HPLC هوية من الجزيء.
ما هو HPLC؟
HPLC (التحليل اللوني السائل عالي الأداء) هي تقنية فصل تفصل مكونات العينة عن بعضها البعض وتجعل كل منها قابلاً للقياس. يتم إذابة العينة ودفعها تحت ضغط عالٍ من خلال عمود مملوء بالجزيئات الدقيقة. كل مكون له تقارب خاص به لمواد التعبئة والتغليف، وبالتالي يستغرق وقتًا أكثر أو أقل للظهور في الطرف الآخر.
يوجد كاشف في نهاية العمود. إنه يسجل ما يمر ومتى، والنتيجة هي مخطط كروماتوغرافي: أثر ذو قمم، حيث تمثل كل قمة مكونًا تم حذفه في تلك اللحظة.
كيف يقوم HPLC بفصل عينة الببتيد؟
بالنسبة للببتيدات، يتم استخدام HPLC ذو الطور العكسي دائمًا تقريبًا: عمود غير قطبي مدمج مع طور مائي متحرك يضاف إليه مذيب عضوي تدريجيًا. كلما كان المكون أكثر كارهًا للماء، كلما طالت مدة بقائه على العمود وتأخر شطفه. يُطلق على وقت الوصول هذا اسم وقت الاحتفاظ.
نظرًا لأن تركيبة الطور المتحرك تتغير أثناء التشغيل - أي التدرج - فإن المكونات التي تقترب من بعضها البعض في حالة كارهة للماء لا تزال تظهر كقمم منفصلة. وهذا هو بالضبط ما تريده مع الببتيد: المنتجات الثانوية ذات الصلة من عملية التوليف تشبه الجزيء المستهدف بشكل وثيق.
ومن أين تأتي نسبة النقاء هذه؟
نسبة النقاء هي نسبة المساحة: مساحة ذروة الببتيد المستهدف مقسومة على المساحة الإجمالية لجميع القمم. بالنسبة للببتيدات، يقيس الكاشف عادة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية بالقرب من 214 نانومتر، وهو الطول الموجي الذي تمتص عنده رابطة الببتيد نفسها - وهو مفيد، لأنه بعد ذلك يتم رؤية كل مكون يشبه الببتيد، وليس فقط تلك التي تحمل حمض أميني عطري.
إذن 99.2% على أ شهادة يعني: 99.2% من مساحة الذروة تنتمي إلى الجزيء المستهدف و 0.8% إلى شيء آخر. تمت تغطية كيفية قراءة مثل هذا التقرير في كيفية قراءة شهادة توثيق البرامج.
النقاء ليس هو نفس محتوى الببتيد
هذا هو المكان الذي يكمن فيه معظم الالتباس: نقاء 99٪ لا يعني أن 99٪ من محتويات القارورة عبارة عن ببتيد. إلى جانب الجزيء نفسه، يحتوي الببتيد المجفف بالتجميد على الماء المتبقي والأيونات المضادة - غالبًا حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) أو أسيتات من تخليق الببتيد. تلك تضيف إلى الوزن في القارورة ولكن ليس إلى منطقة الذروة في اللوني.
وبالتالي فإن صافي محتوى الببتيد هو تحديد منفصل، والذي قد تتضمنه أو لا تتضمنه الشهادة. بالنسبة للأبحاث التي تكون فيها الكمية الدقيقة من المادة مهمة، فهذا هو الرقم الذي يجب النظر إليه، وليس نسبة النقاء. العتبات الخاصة بنا قيد التشغيل معايير الجودة.
ما لا يخبرك به HPLC
يحدد HPLC الكمية ولكنه لا يحدد: وقت الاحتفاظ يتوافق مع المادة دون إثبات المادة التي هي عليها. هذا يحتاج قياس الطيف الكتليالذي يقيس الوزن الجزيئي ويؤكد الهوية الجزيئية. يعد هذان القياسان معًا الحد الأدنى للنظر في دفعة مميزة.
أبعد من ذلك: قياس النقاء لا يقول شيئًا عن العقم أو السموم الداخلية أو الملاءمة لأي تطبيق. من يقيس دفعاتنا، ولماذا هو طرف ثالث، هو قيد التشغيل جانوشيك التحليلي.
هذه المعلومات عامة وتعليمية بطبيعتها. توفر LYSENTA الببتيدات البحثية للأغراض المختبرية والبحثية فقط. ليس للاستهلاك البشري أو الحيواني، وليس دواء وليس نصيحة طبية.
الأسئلة المتداولة حول HPLC
ماذا يعني HPLC؟
يشير HPLC إلى اللوني السائل عالي الأداء. إنها تقنية فصل يتم فيها دفع العينة عبر عمود تحت ضغط مرتفع، بحيث تصل مكوناتها إلى النهاية البعيدة في لحظات مختلفة ويمكن قياسها بشكل فردي.
كيف يتم تحديد النقاء بواسطة HPLC؟
من منطقة القمم في اللوني. يتم التعبير عن مساحة ذروة الببتيد المستهدف كنسبة مئوية من المساحة الإجمالية لجميع القمم. لذا فإن نسبة 99.1% في الشهادة هي نسبة مساحة وليست وزنًا.
هل نقاء 99% هو نفس 99% ببتيد في القارورة؟
لا. نقاء HPLC هو النسبة بين الببتيد المستهدف والمكونات الأخرى المرتبطة بالببتيد التي يراها الكاشف. ولا يتم احتساب الماء المتبقي والأيونات المضادة من عملية التصنيع. صافي محتوى الببتيد هو تحديد منفصل.
هل يمكن لـ HPLC تأكيد نوع الببتيد؟
ليس من تلقاء نفسها. يتوافق وقت الاحتفاظ مع المادة ولكنه لا يثبت هويتها. وهذا يحتاج إلى قياس الطيف الكتلي، الذي يقيس الوزن الجزيئي. HPLC يقول كم، مطياف الكتلة يقول ماذا.
