Chaque certificat d'analyse d'un peptide de recherche comporte un pourcentage de pureté, et ce chiffre est presque toujours déterminé par HPLC. Ce guide explique ce que fait la technique, comment ce pourcentage est obtenu et, surtout, ce qu'elle ne dit pas.
La HPLC sépare les composants d'un échantillon et exprime le peptide cible sous forme de pourcentage de la surface totale du pic. Il s'agit donc d'un rapport, pas d'une pesée : l'eau résiduelle et les contre-ions restent hors de vue, et la HPLC ne confirme pas le résultat. identité de la molécule.
Qu’est-ce que la HPLC ?
La HPLC (Chromatographie Liquide Haute Performance) est une technique de séparation qui sépare les composants d'un échantillon et rend chacun d'eux mesurable. L'échantillon est dissous et entraîné sous haute pression à travers une colonne remplie de fines particules. Chaque composant a sa propre affinité pour ce matériau d'emballage et met donc plus ou moins de temps à apparaître à l'autre extrémité.
Un détecteur se trouve au bout de la colonne. Il enregistre ce qui passe et quand, et le résultat est un chromatogramme : une trace avec des pics, où chaque pic représente un composant élué à ce moment-là.
Comment la HPLC sépare-t-elle un échantillon de peptide ?
Pour les peptides, on utilise presque toujours la HPLC en phase inversée : une colonne non polaire associée à une phase mobile aqueuse à laquelle est progressivement ajouté un solvant organique. Plus un composant est hydrophobe, plus il reste longtemps sur la colonne et plus il est élué tardivement. Cette heure d’arrivée est appelée temps de rétention.
Parce que la composition des déphasages mobiles au cours de l’analyse – un gradient – les composants qui sont proches les uns des autres en termes d’hydrophobie apparaissent toujours sous forme de pics séparés. C’est exactement ce que vous recherchez avec un peptide : les sous-produits associés issus de la synthèse ressemblent beaucoup à la molécule cible.
D'où vient ce pourcentage de pureté ?
Le pourcentage de pureté est un pourcentage de surface : la surface du pic du peptide cible divisée par la surface totale de tous les pics. Pour les peptides, le détecteur mesure généralement l’absorption UV à proximité de 214 nm, la longueur d’onde à laquelle la liaison peptidique elle-même absorbe – utile, car alors chaque composant de type peptidique est vu, pas seulement ceux qui portent un acide aminé aromatique.
Donc 99,2% sur un certificat signifie : 99,2 % de la surface du pic appartenait à la molécule cible et 0,8 % à autre chose. Comment lire un tel rapport est expliqué dans comment lire un COA.
La pureté n'est pas la même chose que la teneur en peptides
C’est là que réside l’essentiel de la confusion : une pureté de 99 % ne signifie pas que 99 % du contenu du flacon est constitué de peptides. Outre la molécule elle-même, un peptide lyophilisé contient de l'eau résiduelle et des contre-ions, souvent de l'acide trifluoroacétique (TFA) ou de l'acétate issu de la synthèse peptidique. Ceux-ci s'ajoutent au poids dans le flacon mais pas à la surface du pic dans le chromatogramme.
La teneur nette en peptides constitue donc une détermination distincte, qu'un certificat peut inclure ou non. Pour les recherches où la quantité exacte de substance compte, c’est le chiffre à considérer, et non le pourcentage de pureté. Nos propres seuils sont activés normes de qualité.
Ce que HPLC ne vous dit pas
L'HPLC quantifie mais n'identifie pas : un temps de rétention est cohérent avec une substance sans prouver de quelle substance il s'agit. Cela a besoin spectrométrie de masse, qui mesure le poids moléculaire et confirme ainsi l'identité moléculaire. Ces deux mesures réunies constituent le minimum pour considérer un lot caractérisé.
Et au-delà de cela : une mesure de pureté ne dit rien sur la stérilité, les endotoxines ou l'adéquation à une quelconque application. Qui mesure nos lots et pourquoi il s'agit d'un tiers ? Janoshik analytique.
Ces informations sont de nature générale et pédagogique. LYSENTA fournit des peptides de recherche à des fins de laboratoire et de recherche uniquement. Non destiné à la consommation humaine ou animale, ni médicament ni avis médical.
Questions fréquemment posées sur la HPLC
Que signifie HPLC ?
HPLC signifie Chromatographie Liquide Haute Performance. Il s'agit d'une technique de séparation dans laquelle un échantillon est entraîné à travers une colonne sous haute pression, de sorte que ses composants arrivent à l'extrémité à différents moments et peuvent être mesurés individuellement.
Comment la pureté est-elle déterminée par HPLC ?
De la zone des pics du chromatogramme. La surface du pic du peptide cible est exprimée en pourcentage de la surface totale de tous les pics. Ainsi, 99,1 % sur un certificat correspond à un pourcentage de superficie et non à une pesée.
Une pureté de 99 % est-elle la même que 99 % de peptide dans le flacon ?
Non. La pureté HPLC est le rapport entre le peptide cible et les autres composants liés au peptide détectés par le détecteur. L'eau résiduelle et les contre-ions issus de la synthèse n'y sont pas comptés. La teneur nette en peptides est une détermination distincte.
La HPLC peut-elle confirmer de quel peptide il s’agit ?
Pas tout seul. Un temps de rétention est cohérent avec une substance mais ne prouve pas son identité. Cela nécessite une spectrométrie de masse, qui mesure le poids moléculaire. La HPLC dit combien, la spectrométrie de masse dit quoi.
