В каждом сертификате анализа исследовательского пептида указан процент чистоты, и этот показатель почти всегда определяется методом ВЭЖХ. В этом руководстве объясняется, что делает этот метод, как формируется этот процент и, что наиболее важно, о чем он не говорит.
ВЭЖХ разделяет компоненты образца и экспрессирует целевой пептид в виде процент от общей площади пика. Так что это соотношение, а не взвешивание: остаточная вода и противоионы остаются вне поля зрения, а ВЭЖХ не подтверждает личность молекулы.
Что такое ВЭЖХ?
ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) — это метод разделения, который разделяет компоненты образца и делает каждый из них измеримым. Проба растворяется и прогоняется под высоким давлением через колонку, заполненную мелкими частицами. Каждый компонент имеет свое собственное сходство с этим упаковочным материалом, и поэтому требуется больше или меньше времени, чтобы появиться на другом конце.
Детектор расположен в конце колонны. Он регистрирует, что и когда проходит, и результатом является хроматограмма: кривая с пиками, где каждый пик соответствует компоненту, элюированному в этот момент.
Как ВЭЖХ разделяет образец пептида?
Для пептидов почти всегда используется обращенно-фазовая ВЭЖХ: неполярная колонка в сочетании с водной подвижной фазой, к которой постепенно добавляется органический растворитель. Чем более гидрофобен компонент, тем дольше он остается на колонке и тем позже он элюируется. Это время прибытия называется временем удержания.
Поскольку состав подвижной фазы изменяется во время анализа (градиент), компоненты, находящиеся близко друг к другу по гидрофобности, все равно проявляются в виде отдельных пиков. Это именно то, что вам нужно от пептида: родственные побочные продукты синтеза очень похожи на целевую молекулу.
Откуда такой процент чистоты?
Процент чистоты представляет собой процент площади: площадь пика целевого пептида, деленная на общую площадь всех пиков. Для пептидов детектор обычно измеряет поглощение УФ-излучения при длине волны около 214 нм, длины волны, при которой поглощается сама пептидная связь, что полезно, поскольку тогда виден каждый пептидоподобный компонент, а не только те, которые несут ароматическую аминокислоту.
Итак, 99,2% на сертификат означает: 99,2% площади пика принадлежало целевой молекуле и 0,8% — чему-то другому. Как читать такой отчет, описано в как читать сертификат подлинности.
Чистота — это не то же самое, что содержание пептидов.
Именно здесь возникает большая часть путаницы: 99% чистота не означает, что 99% содержимого флакона — пептиды. Помимо самой молекулы, лиофилизированный пептид содержит остаточную воду и противоионы — часто трифторуксусную кислоту (ТФУ) или ацетат, образующийся в результате синтеза пептида. Они увеличивают вес флакона, но не увеличивают площадь пика на хроматограмме.
Таким образом, чистое содержание пептидов представляет собой отдельное определение, которое сертификат может включать или не включать. Для исследований, где важно точное количество вещества, следует обращать внимание на эту цифру, а не на процент чистоты. Наши собственные пороги включены. стандарты качества.
О чем вам не расскажет ВЭЖХ
ВЭЖХ дает количественную оценку, но не идентифицирует: время удерживания соответствует веществу, но не доказывает, какое это вещество. Это требует масс-спектрометрия, который измеряет молекулярную массу и таким образом подтверждает молекулярную идентичность. Эти два измерения вместе являются минимумом для определения характеристик партии.
И более того: измерение чистоты ничего не говорит о стерильности, наличии эндотоксинов или пригодности для какого-либо применения. Кто измеряет наши партии и почему это третья сторона, обсуждается ниже. Яношик Аналитик.
Данная информация носит общий и образовательный характер. LYSENTA поставляет исследовательские пептиды только для лабораторных и исследовательских целей. Не для потребления человеком или животными, не в качестве лекарства и не для медицинских консультаций.
Часто задаваемые вопросы о ВЭЖХ
Что означает ВЭЖХ?
ВЭЖХ означает высокоэффективную жидкостную хроматографию. Это метод разделения, при котором образец прогоняется через колонку под высоким давлением, поэтому его компоненты достигают дальнего конца в разные моменты и могут быть измерены индивидуально.
Как чистота определяется методом ВЭЖХ?
По площади пиков на хроматограмме. Площадь пика целевого пептида выражают в процентах от общей площади всех пиков. Таким образом, 99,1% в сертификате — это процент площади, а не взвешивание.
Является ли 99% чистота тем же, что и 99% пептида во флаконе?
Нет. Чистота ВЭЖХ — это соотношение между целевым пептидом и другими компонентами, связанными с пептидом, которые видит детектор. Остаточная вода и противоионы от синтеза в нем не учитываются. Чистое содержание пептидов определяется отдельно.
Может ли ВЭЖХ подтвердить, что это за пептид?
Не сам по себе. Время удерживания соответствует веществу, но не доказывает его идентичность. Для этого нужна масс-спектрометрия, которая измеряет молекулярную массу. ВЭЖХ говорит сколько, масс-спектрометрия говорит что.
