Cada certificado de análise de um peptídeo de pesquisa traz uma porcentagem de pureza, e esse valor é quase sempre determinado por HPLC. Este guia explica o que a técnica faz, como surge essa porcentagem e – o mais importante – o que ela não diz.
A HPLC separa os componentes de uma amostra e expressa o peptídeo alvo como um porcentagem da área total do pico. Portanto, trata-se de uma proporção, não de uma pesagem: a água residual e os contra-íons ficam fora de vista, e a HPLC não confirma a identidade da molécula.
O que é HPLC?
HPLC (cromatografia líquida de alto desempenho) é uma técnica de separação que separa os componentes de uma amostra e torna cada um deles mensurável. A amostra é dissolvida e conduzida sob alta pressão através de uma coluna repleta de partículas finas. Cada componente tem sua própria afinidade com aquele material de embalagem e, portanto, leva mais ou menos tempo para aparecer na outra extremidade.
Um detector fica no final da coluna. Ele registra o que passa e quando, e o resultado é um cromatograma: um traço com picos, onde cada pico representa um componente que eluiu naquele momento.
Como a HPLC separa uma amostra de peptídeo?
Para peptídeos, quase sempre é utilizada HPLC de fase reversa: uma coluna apolar combinada com uma fase móvel aquosa à qual um solvente orgânico é gradualmente adicionado. Quanto mais hidrofóbico for um componente, mais tempo ele permanecerá na coluna e mais tarde será eluído. Esse tempo de chegada é chamado de tempo de retenção.
Como a composição da fase móvel muda durante a corrida – um gradiente – os componentes que ficam próximos uns dos outros na hidrofobicidade ainda aparecem como picos separados. O que é exatamente o que você deseja com um peptídeo: os subprodutos relacionados da síntese se assemelham muito à molécula alvo.
De onde vem essa porcentagem de pureza?
A percentagem de pureza é uma percentagem de área: a área do pico do péptido alvo dividida pela área total de todos os picos. Para peptídeos, o detector normalmente mede a absorção de UV perto de 214 nm, o comprimento de onda no qual a própria ligação peptídica é absorvida – útil, porque então todos os componentes semelhantes a peptídeos são vistos, não apenas aqueles que transportam um aminoácido aromático.
Portanto, 99,2% em um certificado significa: 99,2% da área do pico pertencia à molécula alvo e 0,8% a outra coisa. Como ler esse relatório é abordado em como ler um COA.
Pureza não é o mesmo que conteúdo de peptídeos
É aqui que reside a maior parte da confusão: 99% de pureza não significa que 99% do conteúdo do frasco seja peptídeo. Além da própria molécula, um peptídeo liofilizado contém água residual e contra-íons – geralmente ácido trifluoroacético (TFA) ou acetato da síntese de peptídeos. Estes aumentam o peso no frasco, mas não a área do pico no cromatograma.
O conteúdo líquido de peptídeos é, portanto, uma determinação separada, que um certificado pode ou não incluir. Para pesquisas em que a quantidade exata da substância é importante, esse é o número a ser observado – e não a porcentagem de pureza. Nossos próprios limites estão ativados padrões de qualidade.
O que a HPLC não lhe diz
A HPLC quantifica mas não identifica: um tempo de retenção é consistente com uma substância sem provar de que substância se trata. Isso precisa espectrometria de massa, que mede o peso molecular e assim confirma a identidade molecular. Essas duas medidas juntas são o mínimo para considerar um lote caracterizado.
E além disso: uma medição de pureza não diz nada sobre esterilidade, endotoxinas ou adequação para qualquer aplicação. Quem mede nossos lotes, e por que é um terceiro, está no Janoshik Analítica.
Esta informação é de natureza geral e educativa. LYSENTA fornece peptídeos de pesquisa apenas para fins laboratoriais e de pesquisa. Não é para consumo humano ou animal, não é um medicamento e não é um conselho médico.
Perguntas frequentes sobre HPLC
O que significa HPLC?
HPLC significa Cromatografia Líquida de Alto Desempenho. É uma técnica de separação em que uma amostra é conduzida através de uma coluna sob alta pressão, de modo que seus componentes chegam à extremidade em momentos diferentes e podem ser medidos individualmente.
Como a pureza é determinada por HPLC?
Da área dos picos no cromatograma. A área do pico do peptídeo alvo é expressa como uma percentagem da área total de todos os picos. Portanto, 99,1% num certificado é uma percentagem de área, não uma pesagem.
99% de pureza é igual a 99% de peptídeo no frasco?
Não. A pureza da HPLC é a razão entre o peptídeo alvo e outros componentes relacionados ao peptídeo que o detector vê. A água residual e os contra-íons da síntese não são contabilizados nele. O conteúdo líquido de peptídeos é uma determinação separada.
A HPLC pode confirmar qual é o peptídeo?
Não por conta própria. Um tempo de retenção é consistente com uma substância, mas não prova a sua identidade. Isso precisa de espectrometria de massa, que mede o peso molecular. HPLC diz quanto, espectrometria de massa diz o quê.
