لا يتم حصاد الببتيد البحثي، بل يتم تصنيعه، حمض أميني واحد في كل مرة، على حبة من الراتنج. تشرح هذه الطريقة سبب وجود الأيونات المضادة في القارورة ولماذا لا تصل نسبة النقاء إلى 100 أبدًا. يشرح هذا الدليل العملية.
في تركيب المرحلة الصلبة تنمو السلسلة على دعم قوي، من الطرف C إلى الطرف N، في دورة متكررة من إزالة الحماية والاقتران. كل دورة تترك أ نقص صغير، وتصبح هذه النواقص هي الشوائب ذات الصلة التي يجب على HPLC إزالتها لاحقًا.
لماذا الدعم القوي؟
لأنه يجعل مشكلة الانفصال تختفي: طالما أن الببتيد المتنامي مرتبط بحبة غير قابلة للذوبان، يمكن ببساطة غسل كل الكاشف الزائد. وبدون هذه الحيلة، ستكون هناك حاجة إلى تنقية كاملة بعد كل خطوة، ولسلسلة من ثلاثين حمضًا أمينيًا غير قابلة للتطبيق.
قدم روبرت بروس ميريفيلد هذا المبدأ في عام 1963 وحصل على جائزة نوبل في الكيمياء عنه في عام 1984. تقريبًا كل الببتيد البحثي الاصطناعي الموجود اليوم يأتي عبر هذا الطريق.
الدورة
يمتد التجميع من الطرف C إلى الطرف N، وهو عكس ما يفعله الريبوسوم، ويتكون من دورة واحدة تتكرر عدة مرات مثل وجود الأحماض الأمينية.
- 1رسو
يتم تثبيت الحمض الأميني الطرفي C على الراتنج. وهذا يحدد النهاية التي سيتم تحريرها لاحقًا.
- 2إزالة الحماية
تتم إزالة مجموعة الحماية المؤقتة الموجودة على الطرف N حتى يتمكن هذا الجانب من التفاعل مرة أخرى. في استراتيجية Fmoc المشتركة التي تتم بقاعدة.
- 3اقتران
تتم إضافة الحمض الأميني التالي في شكل منشط ويصنع حمضًا جديدًا الرابطة الببتيدية مع محطة N المحررة. ثم يغسل، وتبدأ الدورة مرة أخرى.
- 4الانقسام
بمجرد اكتمال السلسلة، يتم فصل الببتيد من الراتينج بحمض قوي وتتم إزالة مجموعات الحماية المتبقية.
من أين تأتي الشوائب
كل اقتران وكل إزالة حماية يكون عائدها أقل بقليل من 100%، وعبر عشرات الدورات تتراكم هذه العيوب. إذا فشلت إحدى الاقترانات، تظهر سلسلة تفتقد حمضًا أمينيًا واحدًا فقط. إذا بقيت مجموعة الحماية في مكانها، ينتج عن ذلك جزيء تكون كتلته أقل قليلًا.
تشبه هذه المنتجات الثانوية الجزيء المستهدف إلى حد كبير، ومن هنا ضرورة أن يكون الفصل جيدًا بما يكفي لحلها كذروة منفصلة. كيف يعمل هذا في ما هو HPLC. تستخدم عملية التنقية في الممارسة العملية HPLC التحضيري: وهي نفس التقنية، والتي يتم نشرها الآن للفصل بدلاً من القياس.
من حبة الراتنج إلى القارورة
ويتم الانقسام عادةً باستخدام حمض ثلاثي فلورو أسيتيك، وهذا ما يفسر عودة الأيونات المضادة TFA في المنتج النهائي. يتم وزنها داخل القارورة دون احتساب نسبة النقاء - وهو بالضبط الفرق بين النقاء ومحتوى الببتيد الصافي.
بعد أن يأتي التطهير التجفيد: يخرج الماء بالتسامي ويبقى هو المسحوق الذي تجده في القارورة. ثم يتم تأكيد الهوية عن طريق قياس الطيف الكتلي، تتلقى الدُفعة رقم الدفعة وترتبط بـ a شهادة. عتباتنا موجودة معايير الجودة.
هذه المعلومات عامة وتعليمية بطبيعتها. توفر LYSENTA الببتيدات البحثية للأغراض المختبرية والبحثية فقط. ليس للاستهلاك البشري أو الحيواني، وليس دواء وليس نصيحة طبية.
الأسئلة المتداولة حول تخليق الببتيد
ما هو تخليق الببتيد في المرحلة الصلبة (SPPS)؟
SPPS هي الطريقة القياسية لصنع الببتيدات كيميائيًا. يتم تثبيت الحمض الأميني الأول على دعامة صلبة (حبة راتينج)، وبعد ذلك يتم بناء السلسلة حمض أميني واحد في كل مرة. نظرًا لأن المنتج يظل ملتصقًا بالدعامة، يمكن ببساطة غسل الكاشف الزائد.
في أي اتجاه يتم بناء الببتيد كيميائيا؟
من الطرف C إلى الطرف N، وهو عكس الطريقة التي يقوم بها الريبوسوم. ويترتب على ذلك من الطريقة: الحمض الأميني C- الطرفي هو الحمض الأميني المثبت على حبة الراتنج.
لماذا يوجد TFA في الببتيد المركب؟
لأن الببتيد ينفصل عن المادة الداعمة بحمض ثلاثي فلورو أسيتيك وغالبًا ما يتم تنقيته بعد ذلك باستخدام طور متحرك يحتوي على TFA. ما تبقى هو الأيونات المضادة TFA: فهي تضيف إلى الوزن في القارورة ولكن ليس إلى نسبة النقاء من HPLC.
لماذا لا يكون الببتيد المركب نقيًا بنسبة 100٪ أبدًا؟
كل دورة لديها عائد أقل بقليل من 100%، وتتراكم هذه النواقص الصغيرة على مدى عشرات الخطوات. والنتيجة هي أن السلاسل تفتقد حمضًا أمينيًا واحدًا أو تحتفظ بمجموعة حماية، وهي مركبات تشبه إلى حد كبير الجزيء المستهدف، وبالتالي يجب تنقيتها.
