Исследовательский пептид не собирают, а строят по одной аминокислоте на шарике смолы. Этот метод объясняет, почему во флаконе присутствуют противоионы, и почему процент чистоты никогда не достигает точно 100. В этом руководстве подробно описан процесс.
При твердофазном синтезе цепь растет по твердая поддержкаот С-конца к N-концу в повторяющемся цикле снятия защиты и связывания. Каждый цикл оставляет небольшой дефицит, и эти недостатки становятся соответствующими примесями, которые ВЭЖХ придется удалить позже.
Почему надежная поддержка?
Потому что это устраняет проблему разделения: пока растущий пептид прикреплен к нерастворимой грануле, весь избыток реагента можно просто смыть. Без этого трюка после каждого этапа требовалась бы полная очистка, а для цепочки из тридцати аминокислот это было бы невозможно.
Роберт Брюс Меррифилд представил этот принцип в 1963 году и получил за него Нобелевскую премию по химии в 1984 году. Практически каждый существующий сегодня синтетический исследовательский пептид создается этим путем.
Цикл
Сборка происходит от С-конца к N-концу, в противоположность тому, что делает рибосома, и состоит из одного цикла, повторяемого столько раз, сколько имеется аминокислот.
- 1Закрепление
С-концевая аминокислота фиксируется на смоле. Это определяет, какой конец будет освобожден позже.
- 2Снятие защиты
Временная защитная группа на N-конце удаляется, чтобы эта сторона могла снова реагировать. В обычной стратегии Fmoc это делается с помощью базы.
- 3Муфта
Следующая аминокислота добавляется в активированной форме и образует новую пептидная связь с освобожденным N-концом. Затем стирка, и цикл начинается снова.
- 4Расщепление
После завершения цепи пептид отщепляется от смолы сильной кислотой, а оставшиеся защитные группы удаляются.
Откуда берутся примеси
Каждое соединение и каждое снятие защиты имеет выход чуть ниже 100%, и за десятки циклов этот дефицит суммируется. Если одно соединение не удается, появляется цепь, в которой отсутствует ровно одна аминокислота. Если защитная группа остается на месте, образуется молекула, масса которой немного отличается.
Эти побочные продукты очень похожи на целевую молекулу — отсюда и требование, чтобы разделение было достаточно тонким, чтобы их можно было разделить как отдельный пик. Как это работает, описано в что такое ВЭЖХ. На практике для очистки используется препаративная ВЭЖХ: тот же метод, который теперь применяется для разделения, а не для измерения.
От шарика смолы до флакона
Расщепление обычно осуществляется с помощью трифторуксусной кислоты, и это объясняет, почему противоионы TFA возвращаются в конечный продукт. Они взвешиваются внутри флакона без учета процента чистоты — это именно разница между чистотой и чистым содержанием пептидов.
После очищения наступает лиофилизация: вода уходит в результате сублимации, а остается порошок, который вы найдете во флаконе. Затем личность подтверждается масс-спектрометрия, партия получает номер партии и привязывается к сертификат. Наши пороги включены стандарты качества.
Данная информация носит общий и образовательный характер. LYSENTA поставляет исследовательские пептиды только для лабораторных и исследовательских целей. Не для потребления человеком или животными, не в качестве лекарства и не для медицинских консультаций.
Часто задаваемые вопросы о синтезе пептидов
Что такое твердофазный пептидный синтез (ТФПС)?
SPPS — это стандартный метод химического получения пептидов. Первая аминокислота закрепляется на твердой основе (смоляной бусине), после чего цепь строится по одной аминокислоте. Поскольку продукт остается прикрепленным к подложке, излишки реагента можно просто смыть.
В каком направлении химически строится пептид?
От С-конца к N-концу — в обратном порядке тому, как это делает рибосома. Это следует из метода: С-концевая аминокислота – это та, которая прикреплена к шарику смолы.
Почему в синтезированном пептиде содержится ТЖК?
Потому что пептид отщепляется от носителя трифторуксусной кислотой и часто затем очищается с помощью подвижной фазы, содержащей TFA. Остаются только противоионы TFA: они увеличивают вес флакона, но не увеличивают процент чистоты по данным ВЭЖХ.
Почему синтезированный пептид никогда не бывает на 100% чистым?
Каждый цикл имеет доходность чуть ниже 100%, и эти небольшие недостатки накапливаются на протяжении десятков шагов. В результате в цепях отсутствует одна аминокислота или сохраняется защитная группа — соединения, которые очень похожи на целевую молекулу и поэтому их необходимо очищать.
