Um peptídeo de pesquisa não é colhido, mas construído, um aminoácido de cada vez, em uma gota de resina. Esse método explica por que existem contra-íons no frasco e por que a porcentagem de pureza nunca é exatamente 100. Este guia explica o processo.
Na síntese em fase sólida, a cadeia cresce em uma suporte sólido, do terminal C ao terminal N, em um ciclo repetido de desproteção e acoplamento. Cada ciclo deixa um pequeno déficit, e essas deficiências tornam-se as impurezas relacionadas que a HPLC precisa remover posteriormente.
Por que um suporte sólido?
Porque faz com que o problema de separação desapareça: desde que o peptídeo em crescimento esteja ligado a uma esfera insolúvel, todo o excesso de reagente pode simplesmente ser removido. Sem esse truque, seria necessária uma purificação completa após cada etapa, e para uma cadeia de trinta aminoácidos isso não é viável.
Robert Bruce Merrifield introduziu o princípio em 1963 e recebeu o Prémio Nobel de Química por ele em 1984. Praticamente todos os péptidos de investigação sintéticos existentes hoje surgem através desta via.
O ciclo
A montagem vai do terminal C ao terminal N, o inverso do que um ribossomo faz, e consiste em um ciclo repetido tantas vezes quanto houver aminoácidos.
- 1Ancoragem
O aminoácido C-terminal é fixado à resina. Isso determina qual extremidade será liberada posteriormente.
- 2Desproteção
O grupo protetor temporário no terminal N é removido para que esse lado possa reagir novamente. Na estratégia comum do Fmoc isso é feito com base.
- 3Acoplamento
O próximo aminoácido é adicionado na forma ativada e forma um novo ligação peptídica com o terminal N liberado. Depois uma lavagem e o ciclo recomeça.
- 4Clivagem
Assim que a cadeia estiver completa, o peptídeo é clivado da resina com ácido forte e os grupos protetores restantes são removidos.
De onde vêm as impurezas
Cada acoplamento e cada desprotecção têm um rendimento pouco inferior a 100% e, ao longo de dezenas de ciclos, essas deficiências aumentam. Se um acoplamento falhar, aparece uma cadeia faltando exatamente um aminoácido. Se um grupo protetor permanecer no lugar, resultará uma molécula cuja massa está ligeiramente diferente.
Esses subprodutos se assemelham muito à molécula alvo – daí a exigência de que a separação seja fina o suficiente para ainda resolvê-los como um pico separado. Como isso funciona está em o que é HPLC. Na prática, a purificação utiliza HPLC preparativa: a mesma técnica, agora utilizada para separar em vez de medir.
Do cordão de resina ao frasco
A clivagem normalmente é feita com ácido trifluoroacético, e isso explica por que os contra-íons de TFA voltam no produto final. Eles pesam dentro do frasco sem contar para a porcentagem de pureza – precisamente a diferença entre a pureza e o conteúdo líquido de peptídeos.
Depois que a purificação vem liofilização: a água sai por sublimação e o que resta é o pó que você encontra no frasco. A identidade é então confirmada por espectrometria de massa, o lote recebe um número de lote e fica vinculado a um certificado. Nossos limites estão ativados padrões de qualidade.
Esta informação é de natureza geral e educativa. LYSENTA fornece peptídeos de pesquisa apenas para fins laboratoriais e de pesquisa. Não é para consumo humano ou animal, não é um medicamento e não é um conselho médico.
Perguntas frequentes sobre síntese de peptídeos
O que é síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS)?
SPPS é o método padrão para produzir peptídeos quimicamente. O primeiro aminoácido é ancorado a um suporte sólido (uma conta de resina), após o qual a cadeia é construída, um aminoácido de cada vez. Como o produto permanece preso ao suporte, o excesso de reagente pode simplesmente ser removido.
Em que direção um peptídeo é construído quimicamente?
Do terminal C ao terminal N - o inverso de como um ribossomo faz isso. Isso decorre do método: o aminoácido C-terminal é aquele ancorado ao cordão de resina.
Por que existe TFA em um peptídeo sintetizado?
Porque o peptídeo é clivado do suporte com ácido trifluoroacético e frequentemente purificado posteriormente com uma fase móvel contendo TFA. O que resta são os contra-íons de TFA: eles aumentam o peso no frasco, mas não a porcentagem de pureza da HPLC.
Por que um peptídeo sintetizado nunca é 100% puro?
Cada ciclo tem um rendimento pouco inferior a 100%, e essas pequenas deficiências acumulam-se ao longo de dezenas de etapas. O resultado são cadeias sem um aminoácido ou que retêm um grupo protetor – compostos que se assemelham muito à molécula alvo e, portanto, precisam ser purificados.
