Un péptido de investigación no se cosecha sino que se construye, un aminoácido a la vez, sobre una gota de resina. Ese método explica por qué hay contraiones en el vial y por qué un porcentaje de pureza nunca es exactamente 100. Esta guía explica el proceso.
En la síntesis en fase sólida la cadena crece sobre una soporte sólido, del extremo C al N, en un ciclo repetido de desprotección y acoplamiento. Cada ciclo deja un pequeño déficit, y esas deficiencias se convierten en las impurezas relacionadas que el HPLC debe eliminar más adelante.
¿Por qué un apoyo sólido?
Porque hace que el problema de separación desaparezca: siempre que el péptido en crecimiento esté adherido a una perla insoluble, todo el exceso de reactivo puede simplemente eliminarse mediante lavado. Sin ese truco, sería necesaria una purificación completa después de cada paso, y para una cadena de treinta aminoácidos que no es viable.
Robert Bruce Merrifield introdujo el principio en 1963 y recibió el Premio Nobel de Química en 1984. Prácticamente todos los péptidos de investigación sintéticos que existen hoy en día se obtienen a través de esta ruta.
el ciclo
El ensamblaje se realiza desde el extremo C al extremo N, lo contrario de lo que hace un ribosoma, y consiste en un ciclo repetido tantas veces como aminoácidos hay.
- 1Anclaje
El aminoácido C-terminal se fija a la resina. Eso determina qué extremo se libera más tarde.
- 2Desprotección
El grupo protector temporal en el extremo N se elimina para que ese lado pueda reaccionar nuevamente. En la estrategia común del Fmoc que se hace con una base.
- 3Enganche
El siguiente aminoácido se añade en forma activada y forma un nuevo enlace peptídico con el extremo N liberado. Luego un lavado y el ciclo comienza de nuevo.
- 4Escisión
Una vez que se completa la cadena, el péptido se escinde de la resina con un ácido fuerte y se eliminan los grupos protectores restantes.
De donde vienen las impurezas
Cada acoplamiento y cada desprotección tiene un rendimiento de poco menos del 100% y, a lo largo de docenas de ciclos, esos déficits se acumulan. Si falla un acoplamiento, aparece una cadena a la que le falta exactamente un aminoácido. Si un grupo protector permanece quieto, resulta una molécula cuya masa está ligeramente desviada.
Esos subproductos se parecen mucho a la molécula objetivo, de ahí el requisito de que la separación sea lo suficientemente fina como para resolverlos como un pico separado. Cómo funciona eso está en ¿Qué es la HPLC?. En la práctica, la purificación utiliza HPLC preparativa: la misma técnica, ahora utilizada para separar en lugar de medir.
De la perla de resina al vial
La escisión normalmente se realiza con ácido trifluoroacético y eso explica por qué los contraiones de TFA regresan al producto final. Pesan dentro del vial sin contar para el porcentaje de pureza, precisamente la diferencia entre pureza y contenido neto de péptidos.
Después de la purificación viene liofilización: el agua sale por sublimación y lo que queda es el polvo que encuentras en el vial. Luego se confirma la identidad mediante espectrometría de masas, el lote recibe un número de lote y está vinculado a un certificado. Nuestros umbrales están en estándares de calidad.
Esta información es de naturaleza general y educativa. LYSENTA suministra péptidos de investigación Sólo para fines de laboratorio y de investigación.. No para consumo humano o animal, ni medicamento ni consejo médico.
Preguntas frecuentes sobre la síntesis de péptidos
¿Qué es la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS)?
SPPS es el método estándar para producir péptidos químicamente. El primer aminoácido se ancla a un soporte sólido (una perla de resina), después de lo cual la cadena se construye un aminoácido a la vez. Debido a que el producto permanece adherido al soporte, el exceso de reactivo puede simplemente eliminarse mediante lavado.
¿En qué dirección se construye químicamente un péptido?
Del extremo C al extremo N: al revés de cómo lo hace un ribosoma. Esto se desprende del método: el aminoácido C-terminal es el que está anclado a la perla de resina.
¿Por qué hay TFA en un péptido sintetizado?
Porque el péptido se escinde del soporte con ácido trifluoroacético y a menudo se purifica posteriormente con una fase móvil que contiene TFA. Lo que queda son los contraiones de TFA: se suman al peso del vial pero no al porcentaje de pureza de la HPLC.
¿Por qué un péptido sintetizado nunca es 100% puro?
Cada ciclo tiene un rendimiento de poco menos del 100% y esos pequeños déficits se acumulan a lo largo de docenas de pasos. El resultado son cadenas a las que les falta un aminoácido o retienen un grupo protector: compuestos que se parecen mucho a la molécula objetivo y, por lo tanto, deben purificarse.
