Un peptide de recherche n’est pas récolté mais construit, un acide aminé à la fois, sur une perle de résine. Cette méthode explique à la fois pourquoi il y a des contre-ions dans le flacon et pourquoi un pourcentage de pureté n'est jamais exactement de 100. Ce guide décrit le processus.
Dans la synthèse en phase solide, la chaîne se développe sur une soutien solide, de l'extrémité C à l'extrémité N, dans un cycle répété de déprotection et de couplage. Chaque cycle laisse un petit manque à gagner, et ces déficits deviennent les impuretés associées que la HPLC doit éliminer plus tard.
Pourquoi un support solide ?
Parce que cela fait disparaître le problème de séparation : tant que le peptide en croissance est attaché à une bille insoluble, tout excès de réactif peut simplement être éliminé par lavage. Sans cette astuce, une purification complète serait nécessaire après chaque étape, et pour une chaîne de trente acides aminés qui n'est pas exploitable.
Robert Bruce Merrifield a introduit le principe en 1963 et a reçu pour cela le prix Nobel de chimie en 1984. Pratiquement tous les peptides de recherche synthétiques existants aujourd'hui sont obtenus par cette voie.
Le cycle
L'assemblage s'étend de l'extrémité C à l'extrémité N, à l'inverse de ce que fait un ribosome, et consiste en un cycle répété autant de fois qu'il y a d'acides aminés.
- 1Ancrage
L'acide aminé C-terminal est fixé à la résine. Cela détermine quelle extrémité est libérée plus tard.
- 2Déprotection
Le groupe protecteur temporaire sur l'extrémité N-terminale est supprimé afin que ce côté puisse réagir à nouveau. Dans la stratégie Fmoc commune, cela se fait avec une base.
- 3Couplage
L'acide aminé suivant est ajouté sous forme activée et crée un nouveau liaison peptidique avec le N-terminus libéré. Puis un lavage, et le cycle recommence.
- 4Clivage
Une fois la chaîne terminée, le peptide est clivé de la résine avec un acide fort et les groupes protecteurs restants sont éliminés.
D'où viennent les impuretés
Chaque couplage et chaque déprotection ont un rendement légèrement inférieur à 100 %, et sur des dizaines de cycles, ces déficits s'additionnent. Si un couplage échoue, une chaîne manquant exactement d’un acide aminé apparaît. Si un groupe protecteur reste en place, il en résulte une molécule dont la masse est légèrement altérée.
Ces sous-produits ressemblent beaucoup à la molécule cible – d’où l’exigence que la séparation soit suffisamment fine pour les résoudre en un pic distinct. Comment ça marche est dans qu'est-ce que la HPLC. En pratique, la purification utilise la HPLC préparative : la même technique, désormais déployée pour séparer plutôt que pour mesurer.
De la perle de résine au flacon
Le clivage est généralement effectué avec de l'acide trifluoroacétique, ce qui explique pourquoi les contre-ions TFA reviennent dans le produit final. Ils pèsent à l’intérieur du flacon sans compter dans le pourcentage de pureté – précisément la différence entre la pureté et la teneur nette en peptides.
Après la purification vient lyophilisation: l'eau sort par sublimation et ce qui reste c'est la poudre que vous trouvez dans la fiole. L'identité est ensuite confirmée par spectrométrie de masse, le lot reçoit un numéro de lot et est lié à un certificat. Nos seuils sont activés normes de qualité.
Ces informations sont de nature générale et pédagogique. LYSENTA fournit des peptides de recherche à des fins de laboratoire et de recherche uniquement. Non destiné à la consommation humaine ou animale, ni médicament ni avis médical.
Questions fréquemment posées sur la synthèse peptidique
Qu’est-ce que la synthèse peptidique en phase solide (SPPS) ?
Le SPPS est la méthode standard pour fabriquer chimiquement des peptides. Le premier acide aminé est ancré à un support solide (une perle de résine), après quoi la chaîne se construit un acide aminé à la fois. Le produit restant attaché au support, l’excès de réactif peut simplement être éliminé par lavage.
Dans quelle direction un peptide est-il construit chimiquement ?
De l’extrémité C à l’extrémité N – l’inverse de la façon dont un ribosome le fait. Cela découle de la méthode : l’acide aminé C-terminal est celui ancré à la bille de résine.
Pourquoi y a-t-il du TFA dans un peptide synthétisé ?
Parce que le peptide est clivé du support avec de l'acide trifluoroacétique et souvent purifié ensuite avec une phase mobile contenant du TFA. Ce qui reste, ce sont des contre-ions TFA : ils s’ajoutent au poids dans le flacon mais pas au pourcentage de pureté obtenu par HPLC.
Pourquoi un peptide synthétisé n’est-il jamais pur à 100 % ?
Chaque cycle a un rendement légèrement inférieur à 100 %, et ces petits déficits s'accumulent sur des dizaines d'étapes. Le résultat est que les chaînes manquent d’un acide aminé ou conservent un groupe protecteur – des composés qui ressemblent beaucoup à la molécule cible et doivent donc être purifiés.
